發(fā)布時(shí)間: 2022-11-12 點(diǎn)擊次數: 398次
雞透明質(zhì)酸檢測試劑盒的使用步驟和方法:
一、樣品DNA的制備
用自選方法提取待測樣品的總DNA。注意:待測樣品的DNA純化方法是決定檢測靈敏度的關(guān)鍵因素。如果不能很好純化樣品DNA,后面的PCR再靈敏也不能提高整體檢測靈敏度。
二、制備TB基因標準曲線(xiàn)
?。ㄒ?0-10E6這6個(gè)10倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進(jìn)行,千萬(wàn)不能污染樣品或雞透明質(zhì)酸檢測試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩定性和避免擴散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體病毒做陽(yáng)性對照,只提供沒(méi)有傳染性的、可以直接使用的DNA片段作為陽(yáng)性對照。
1.標記6個(gè)離心管,分別為6,5,4,3,2和1號。
2.用帶芯槍頭分別加入45μL超純水(建議用帶芯槍頭,下同)。
3.先將雞透明質(zhì)酸檢測試劑盒提供的陽(yáng)性對照用超純水10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL(注:請不要將雞透明質(zhì)酸檢測試劑盒提供的標準品一次性稀釋至10E7拷貝/μL,建議每次稀釋10倍剃度稀釋?zhuān)荻认♂屩?0E7拷貝/μL)。
4.在6號管中加入5μL10E7拷貝/μL的TB陽(yáng)性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得10E6拷貝/μL的TB陽(yáng)性對照。
5.換槍頭,從6號管中取5μL溶液到5號管中,充分震蕩1分鐘,得10E5拷貝/μL的TB陽(yáng)性對照。
6.換槍頭,從5號管中取5μL溶液到4號管中,得10E4拷貝/μL的TB陽(yáng)性對照。
7.重復上面的操作直到得到從10E6拷貝/μL到10E1拷貝/μL6個(gè)稀釋度的TB陽(yáng)性對照。
8.NC管中不加任何陽(yáng)性對照。
9.從1-6號管中分別取5μL和待測樣品一起進(jìn)行定量PCR(見(jiàn)下步),每個(gè)樣品做3次重復。PCR后得到每個(gè)陽(yáng)性對照稀釋樣品的熒光PCRCt值,并以之為縱軸,以濃度的對數值為橫軸,繪制標準曲線(xiàn)。