ELISA吸附測定法

1 標本的采取和保存
可用作ELISA測定的標本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進(jìn)行測定（如血清、尿液），有些則需經(jīng)預處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測均以血清為標本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標本需借助于抗凝劑，而血清標本只要待血清自然凝固、xie塊收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫學(xué)檢驗中均以血清作為檢測標本。在ELISA中血漿和血清可同等應用。血清標本可按常規方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時(shí)會(huì )釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會(huì )增加非特異性顯色。
血清標本宜在新鮮時(shí)檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會(huì )產(chǎn)生假陽(yáng)性反應。如在冰箱中保存過(guò)久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說(shuō)來(lái)，在5天內測定的血清標本可放置于4℃，超過(guò)一周測定的需低溫冰存。凍結血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢吮緫入x心或過(guò)濾，澄清后再檢測。反復凍融會(huì )使抗體效價(jià)跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應注意無(wú)菌操作，也可加入適當防腐劑。
2 試劑的準備
按試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求準備實(shí)驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液應用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時(shí)放回冰箱保存。
加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時(shí)應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡
加標本一般用微量加樣器，按規定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結合物應用液和底物應用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成。
4 保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后?？乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation)，有人稱(chēng)之為孵育，在ELISA中似不恰當。